Определение чувствительности микробов к антибиотикам с помощью дисков в повседневной клинической практике

Содержание

Методы определения чувствительности к антибиотикам

Определение чувствительности микробов к антибиотикам с помощью дисков в повседневной клинической практике

Лечение антибиотиками можно проводить двумя способами. Первый — этиотропный, когда выделен возбудитель и определена чувствительность его к антибактериальным агентам. Второй — эмпирический, основанный на знании природной резистентности, эпидемиологических данных и результатов чувствительности к антибиотикам в регионе или стационаре.

В обоих случаях определение чувствительности к антибиотикам  — неотъемлемый элемент рациональной терапии. В этой статье massmedika расскажет о некоторых из них.

В основе большинства методов лежит определение минимальной подавляющей концентрации (МПК). МПК (иногда минимальная ингибирующая концентрация) — наименьшая концентрация антимикробного агента, которая в пробирке полностью подавляет видимый невооруженным глазом рост микроорганизмов. Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл

Методы определения МПК

К методам определения МПК относятся:

  1. Методы разведения
    1. Методы разведения (дилюции) в бульоне.
      1. Метод микродилюции
      2. Метод макродилюции
    2. Методы разведения в агаре
  2. Диффузионные методы
    1. с использованием дисков с антибиотиками
    2. с помощью E-тестов.

Методы разведения

Ниже приведен алгоритм проведения метода разведения в бульоне.

Приготовление заданных разведений

Готовится бульон, содержащий убывающее количество антибиотика,

также готовится контроль, не содержащий антибактериального агента.

Добавление бактериальной суспензии

К каждому из разведений антибиотика добавляется определенное количество выделенных бактерий.

Инкубация в течение 1-й ночи

Пробирки, содержащие бульон, антибиотик и бактерии оставляем на ночь при t=35-37о .

Анализ результатов

Мутный бульон свидельствует о росте бактерий. Минимальное содержание антибиотика, где бульон будет свободен от роста бактерий, будет считаться МПК для данного штамма.

Процедура аналогичная для метода разведения в агаре. Метод микродилюции отличается от метода макродилюции объемом используемомого материала.

Диффузионные методы

Определение чувствительности диско-диффузионным методом предполагает следующие этапы:

Помещение бактерий

Помещение суспензии бактерии заданной концентрации (1-2 х 108  КОЕ/мл) в чашку Петри с агаром.

Помещение дисков с антибиотиками

Коммерческие диски, с нанесенным антибиотиком, помещаются в чашку Петри. Диски равномерно распределены по поверхности агара. Антибиотик начинает мгновенно распространяться из диска на поверхность чашки Петри, создавая градиент концентрации таким образом, что наибольшее содержание антибиотика находится возле диска.

Инкубация на сутки

Чашка Петри, содержащая питательную среду (агар), суспензию бактерии и диски с антибиотиками помещаются в термостат для инкубации на сутки при при t=35-37о

E-TEST

E-TEST (BioMerieux) — коммерческий тест, который представляет из себя полоску с нанесенным антибиотиком. Антибактериальное вещество наносится по градиенту концентрации от высокого к низкому, со шкалой, отображающей концентрацию антибиотика в данном месте.

E-test — быстрый и простой метод, в то же время достаточно дорогой, так как для каждого антибиотика необходима отдельная полоска.

Механизм-специфические тесты

Наличие у бактерии определенного механизма резистентности может быть определено механизм-специфическими тестами. Например, наличие b-лактамаз можно определить в  хромогенном тесте на цефалоспориназы ( Цефиназный диск от BD Microbiology Systems ).

Цефиназный диск будет полезен для определения резистентности к пенициллинам/цефалоспоринам у штаммов Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus, Haemophilus influenzae, энтерококков и некоторых аэробных бактерий. Метод не стоит использовать для выявления b-лактамаз широкого спектра.

Генетические методы

Так как резистентность закодирована в генах, некоторые методы генотипирования могут быть использованы для их выявления. Большинство из генетических методов являются высокочувствительными и быстрыми. Стоит однако помнить, что присутствие генов резистентности не всегда означает, что терапия будет неэффективна. Многое зависит от степени экспрессии гена резистентности.

Источник: https://massmedika.in.ua/metodi_opredeleniya_chuvstvitelnosti/

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков и серийных разведений

Определение чувствительности микробов к антибиотикам с помощью дисков в повседневной клинической практике

В медицине различают этиотропный и эмпирический подход к лечению препаратами. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам играет в этом разделении решающую роль.

Эмпирическое лечение подразумевает выяснение естественной бактериальной чувствительности и эпидемиологических сведений об устойчивости микроорганизмов.

Учитываются также данные клинических исследований, которые контролируются специалистами.

Преимуществом эмпирического подхода в назначении больному антибиотиков является то, что исключаются затраты времени, финансовых расходов на дополнительные, диагностически неинформативные исследования.

При полном отсутствии эффекта от такого лечения антибиотиками, назначают этиотропное. Назначение больному антибактериальных препаратов этиотропно подразумевает выделение возбудителя заболевания из биологического материала больного, определение чувствительности инфекционного агента к антибиотикам различных групп.

Методики установления восприимчивости

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам разделяют на две группы. К диффузионным относятся методы:

  • с применением дисков, включающих антибиотики;
  • с применением Е-тестов.

Методики разведения для определения чувствительности выполняются:

  • с применением жидкой среды питания (бульон) – метод серийных разведений;
  • на агаре.

Согласно полученным данным, все бактерии разделяют на 3 типа:

  • чувствительные;
  • умеренно устойчивые;
  • резистентные, согласно методике пограничных концентраций.

Пограничные концентрации зафиксированы в стандартизированных данных NCCLS (США). Данные нормы применяются в клинических либо микробиологических научных исследованиях чувствительности. Наиболее часто применяют методы дисков и серийных разведений.

Чувствительность бактерий к антибиотикам предполагает анализ результатов на основании двух принципов: клинический и морфологический. Клинически определяется эффективность ведения лечения, а морфологически оценивается распределение действующих антибиотиков.

Для клинической расшифровки результата исследования оцениваются в случае использования стандартизированных доз антибактериальных препаратов для заболеваний. Лечение дает хороший положительный эффект.

Устойчивые же к антибиотикам бактерии отличаются тем, что в процессе лечения не теряют своей жизнедеятельности и способности к размножению. Такие микробы именуются как резистентные.

Существует также группа с промежуточной резистентностью бактериальной клетки. Вызываемые такими бактериями заболевания могут успешно лечиться только при использовании максимальных дозировок антибактериального препарата.

Показатель чувствительности по МБК

Иногда проведенных результатов оказывается недостаточно. В таких случаях стоит определить минимальную бактерицидную концентрацию (МБК). Данный показатель отражает минимальное количество антибактериального препарата для ликвидации микробов практически на 100% на протяжении некоторого времени.

Методика с применением дисков

Исследование чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам методом дисков заключается в засевании исследуемой культуры бактерий на среду АГВ либо питательный агар.

Затем на засеянный участок при помощи пинцета располагают специальные диски из бумаги, содержащие разные дозы лекарственных средств.

При температурном режиме 37°С выжидают сутки, одновременно оценивая зоны задержки роста культуры.

Для наиболее точных результатов рекомендуется применять стандартные питательные среды и диски. Методика дисков не отличается 100% достоверностью. Большей информативностью обладает метод серийных разведений.

Серийные разведения и их значение

Метод серийных разведений позволяет определить минимально возможную концентрацию антибактериального препарата, которая угнетает рост и размножение микробов. Начинают с приготовления основного раствора с содержанием специального растворителя и медикаментозного средства.

Затем к каждому разведению прибавляют по 0,1 мл культуры бактерий (до 107 микробов в 1 мл), одна из них (последняя) – контрольная. Затем также выжидают сутки при температуре 37°С. Все пробирки мутнеют (кроме контрольной).

В результате сравнения степени помутнения с эталоном определяют, какая бактерия подлежит устранению.

Оценивают результаты метода серийных разведений соответственно таблицам пограничных значений. При применении метода серийных разведений определяют группы чувствительных, умеренно устойчивых и устойчивых бактериальных микроорганизмов.

Работаю врачом ветеринарной медицины. Увлекаюсь бальными танцами, спортом и йогой. В приоритет ставлю личностное развитие и освоение духовных практик. Любимые темы: ветеринария, биология, строительство, ремонт, путешествия. Табу: юриспруденция, политика, IT-технологии и компьютерные игры.

Источник: https://probakterii.ru/prokaryotes/in-medicine/chhuvstvitelnost-bakterij-k-antibiotikam.html

Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам – Травматолог РО

Определение чувствительности микробов к антибиотикам с помощью дисков в повседневной клинической практике

До последнего времени пользовались критериями чувствительности бактерий к антибиотикам по Kirby (1957), которые проводятся в большинстве руководств по антибиотикотерапии.

Схема Кирби является ориентировочной, потому что критерии чувствительности часто могут зависеть от многих причин: вида возбудителя, локализации инфекционного процесса, способа введения препарата и возможной его концентрации в очаге поражения.

Существуют различные методы определения чувствительности микробов к антибиотикам, которые до последнего времени не были унифицированы. Однако в 1975 г.

вышел приказ Министерства здравоохранения СССР № 250 об унификации методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам, которым обязаны все пользоваться.

В этом приказе также дано подробное описание методов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, сульфаниламидам и нитрофурановым препаратам.

Чувствительность микробов чаще всего определяют методом бумажных индикаторных дисков или путем серийных разведений антибиотиков на жидких или плотных питательных средах, а также различными ускоренными способами, которыми мы пользовались.

Диффузия в агар

Метод индикаторных бумажных дисков —- общепринятый метод определения чувствительности для практических целей, но дающий лишь ориентировочные (качественные) данные. Этот метод основан на способности антибиотика диффундировать в плотную питательную среду.

Комитет по стандартизации ВОЗ в Стокгольме 11— 17/XI 1968 г. принял рекомендации по международной стандартизации дисков с антибиотиками (Г. Ф. Гаузе, 1968, 1969).

На основании измерения диаметров зон задержки роста бактерий вокруг дисков с определенной концентрацией антибиотиков можно рассчитать МПК- Концентрация каждого препарата в диске подобрана с таким расчетом, чтобы вызвать диффузию антибиотика в окружающую среду — она примерно такая, какую можно создать при стандартных дозах антибиотика в крови. В настоящее время в Советском Союзе выпущены диски с определенной концентрацией антибиотика.

Результаты оценивают после 16—18 ч инкубации чашек в термостате по диаметру зон задержки роста микроорганизмов вокруг диска, включая и диаметр самого диска.

Отсутствие зон задержки роста вокруг диска указывает на то, что исследуемая культура нечувствительна к данной концентрации антибиотиков. Зоны диаметром до 10 мм свидетельствуют о малой чувствительности, более 10 мм — о чувствительности.

Чем больше зона задержки роста исследуемой культуры, тем выше ее чувствительность к данному антибиотику. На диффузии антибиотиков в питательную среду основан также метод «лунок», канавки, цилиндриков, пластинок, таблеток.

Разведение в жидких и плотных питательных средах

Для более точного (количественного) определения чувствительности бактерий, с учетом минимальной подавляющей концентрации антибиотика, применяется метод серийных последовательных разведений на жидких и плотных питательных средах.

Готовят взвесь суточной агаровой культуры исследуемого микроба и в каждую пробирку добавляют по 0,1 мл приготовленной взвеси из расчета 105 микробных тел на 1 мл среды. Одна пробирка является контрольной (без антибиотика). Пробирки удерживают в течение 18 ч в термостате при температуре 37 С.

Результаты учитывают по отсутствию или наличию роста микробов в среде с различной концентрацией антибиотика. Последняя пробирка с задержкой роста (прозрачный бульон) содержит минимальную подавляющую рост испытуемого штамма концентрацию антибиотика (МПК).

Установленная МПК является бактериостатической.

Для определения бактерицидной концентрации из пробирок с отсутствием видимого роста производят посев на агар, после

24_ 48 ч инкубации в термостате отмечают наименьшую концентрацию антибиотика в пробирке, посев из которой не дал роста на чашке с агаром.

Для определения чувствительности методом серийных разведении на плотных питательных средах таким же образом готовят серию разведений антибиотиков в агаре, равномерно смешивая раствор антибиотика с питательной средой, которую затем разливают _ (по 20 мл) по чашкам Петри. Чашку делят на секторы, на каждый из которых засевают исследуемый штамм. Результаты учитывают после 18—24 ч инкубации в термостате при температуре 3/ U оа МПК для данного штамма принимают концентрацию, при которой рост на агаре отсутствует.

Метод разведения в агаре на чашках Петри не следует применять при оценке чувствительности протея, дающего ползучий рост, а также ассоциаций микробов, в состав которых входит протей.

Определение чувствительности описанными методами требует не менее 24 ч с момента выделения культуры, на которое в свою очередь уходит 24 ч, поэтому на анализ нужно не менее 48 ч.

Ускоренные методы

При необходимости более быстро получить сведения о чувствительности возбудителя применяют ускоренные методы: некоторые из них позволяют выдать в клинику результаты исследований через 5—6 ч. Большинство этих методов основано на способности микробов изменять окислительно-восстановительный потенциал среды (И. В. Власова, 1961).

Однако при раневой инфекции, когда возбудитель часто не известен и из раны высевается ассоциация микробов, эти методы неприемлемы.

Для быстрого ориентировочного определения чувствительности раневой микрофлоры к антибиотикам ис

пользуется другой экспресс-метод (сообщение Комитета экспертов по антибиотикам, ВОЗ, 1961 г., по стандартизации методов определения чувствительности микробов). Делают посев содержимого раны сразу же с тампона на 1 мл мясопептонного бульона, выливают на чашку Петри с питательным агаром и накладывают индикаторные диски.

Можно пользоваться методом непосредственного посева раневого отделяемого на среды с антибиотиками (Г. М.

Беленькая, 1957), что дает возможность определить частоту возникновения устойчивых к данному антибиотику форм бактерий (путем подсчета микроколоний) и составить представление о чувствительности всей микробной ассоциации, высеваемой из раны.

Контролем служат среды без антибиотиков, на которые засеян тот же материал. При использовании этих методов клиницисты получают ориентировочный ответ о чувствительности микробов к антибиотикам через 16—18 ч после взятия материала.

Определение чувствительности
микробных ассоциаций

Относительно определения чувствительности микробных ассоциаций к антибиотикам мнения исследователей расходятся.

В случае раневой инфекции, при которой чаще встречается не один, а несколько возбудителей и сопутствующая им микрофлора, целесообразно определять чувствительность всей микробной ассоциации и только при необходимости выделять из нее отдельные культуры для определения чувствительности каждой из них.

Степень чувствительности возбудителей раневой инфекции к антибиотикам определяется чувствительностью не только самого возбудителя в ране, но и сопутствующей ему микрофлоры, если в инфекционном очаге находится ассоциация микробов. Устойчивость чувствительного возбудителя к антибиотикам может повышаться под влиянием высокоустойчивых видов микро

бов, а слабочувствительного при росте с высокочувствительными микроорганизмами не только не повышается, а даже несколько снижается (В. М. Световидова, I960). Это явление может быть объяснено феноменом трансформации ДНК-резистентного штамма.

Поэтому при лабораторном исследовании раневого содержимого важно учитывать чувствительность всей микробной ассоциации, так как влияние антибиотиков на ассоциации микробов заметно отличается от действия их на отдельные виды бактерий (Л. А.

Сысоева, 1964, и др.).

Метод «зеркальных» отпечатков

Для выяснения действия антибиотиков на микробы, располагающиеся внутриклеточно, применяется метод «зеркальных» отпечатков, предложенный В. М. Берманом и Е. М. Славской (1958), который основан на положении И. И- Мечникова о фазах фагоцитарной реакции.

В качестве материала, содержащего лейкоциты, используют содержимое ран, пунктатов или кровь больного, которые смешивают в равных объемах со взвесью суточной агаровой культуры микробов с мутностью в 1 млрд, микробных тел, выделенных из раны этого же больного.

Полученную смесь инкубируют 30 мин в термостате при температуре 37 °С, центрифугируют и взвесь, состоящую из исследуемых лейкоцитов и микробов, наносят в виде тонкого мазка на чашки Петри с агаром, содержащим различные концентрации испытуемого антибиотика.

Чашки Петри с нанесенной на поверхность агара леикоцитарно- микробной взвесью помещают в термостат на 3 ч. Контролем служит та же лейкоцитарно-микробная взвесь на чашках с агаром, не содержащим антибиотика. После инкубации в термостате с поверхности агара предметным стеклом делают отпечаток, который подсушивают на воздухе, фиксируют смесью Никифорова и окрашивают по способу Романовского.

Известно, что палочковидные формы микробов в конце лаг-фазы способны достигать максимальных размеров (феномен «юного гигантизма»), что можно было наблюдать при использовании данного метода.

Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Рис. 8- 9. Незавершенный фагоцитоз.

Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Рис. 10. Завершенный фагоцитоз.

Каждый препарат-отпечаток, полученный с чашек Петри, содержавших различные концентрации антибиотиков, изучают в сравнении с контрольными отпечатками из чашек без антибиотиков.

В контрольных препаратах после 3 ч инкубации чашек в термостате в мазках-отпечатках обнаруживаются свободно лежащие вне лейкоцитов бактерии, которые размножаются и приобретают гигантские размеры (рис.

8); внутри лейкоцитов микробы или беспрепятственно размножаются и морфологически бывают сходны с микробами вне лейкоцитов (незавершенный фагоцитоз; рис. 9), или же не размножаются и сохраняют свою исходную величину (завершенный фагоцитоз; рис. 10).

На препаратах-отпечатках со сред, содержавших антибиотики, можно наблюдать различные картины.

1.   Вне лейкоцитов: а) устойчивые к антибиотикам бактерии размножаются и морфологически сходны с микробами на контрольных препаратах (см. рис.

8); б) размножение чувствительных к антибиотикам бактерий тормозится и микробные клетки сохраняют свою исходную величину (рис.

11); в) под влиянием антибиотиков бактерии приобретают вид длинных нитей с пустотами и перетяжками в середине — дезинтеграция микробной клетки (рис. 12).

2.   Внутри лейкоцитов выявляется картина завершенного (см. рис. 10) или незавершенного (см. рис. 9) фагоцитоза, которая меняется под действием антибиотиков.

Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Рис. 11. Бактерии, чувствительные к антибиотикам.

По морфологии микробов в контрольных И ОПЫТНЫХ препаратах можно судить о задерживающем рост или повреждающем действии антибиотика на бактерии, расположенные не только вне-, но и внутриклеточно, чего нельзя учесть при определении чувствительности другими методами.

Нарушение переваривающей способности лейкоцитов под действием антибиотиков объясняет одну из причин наблюдающегося иногда расхождения между лабораторными данными о чувствительности микрофлоры к антибиотикам и клиническим эффектом последних.

Если при чувствительной к антибиотикам микрофлоре и правильно выбранных показаниях получить клинический эффект не удается, следует обычные способы определения чувствительности микрофлоры к антибиотикам дополнить методом «зеркальных» отпечатков.

На практике иногда наблюдается некоторое несоответствие результатов лабораторного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам с клиническим течением заболевания, хотя расхождения эти невелики.

Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Рис. 12, Дезинтеграция микробных клеток под влиянием антибиотиков.

Из разных лабораторий можно получить разноречивые сведения о чувствительности или устойчивости одного и того же штамма микроба.

Расхождение результатов исследований может зависеть от особенностей методов определения чувствительности, различных питательных сред с разными pH, посевной дозы микробов и времени преддиффузии.

В связи с этим некоторые клиницисты берут под сомнение результаты лабораторных исследований чувствительности и основывают лечение только на клинических данных.

В. МС.30.03.2016

Опт. МС.30.03.2016

Источник: http://travma-ro.ru/informatsiya/biblioteka/himioterapiya-ranevoy-infektsii-v-travmatologii-i-ortopedii-v-m-melnikova-moskva-meditsina-1975/1000-2/

Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Определение чувствительности микробов к антибиотикам с помощью дисков в повседневной клинической практике
Классификация, общие подходы к проведению. Диффузионные методы: метод бумажных дисков, Е-тест.   Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам делятся на 2 группы: 1. Диффузионные методы: • с использованием дисков с антибиотиками • с помощью Е-тестов 2.

      Методы серийных разведений: • разведение в жидкой питательной среде (бульоне) • разведение в агаризованной среде Методы определения чувствительности были разработаны во второй половине 60-х – начале 70-х годов XX века и с тех пор с методической точки зрения не претерпели принципиальных изменений.

Для всех методов общими являются следующие этапы: – приготовление и проверка качества питательных сред – приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма) – инокуляция – для дифузионных методов – этап наложения дисков или полосок Е-теста на плотную питательную среду.

– инкубирование – учет и интерпретация результатов – формулировка рекомендаций по Лечению Диффузионные методы основаны на диффузии антибактериального препарата (АБП) из носителя в плотную питательную среду, инокулированную микроорганизмом, и регистрации диаметра зоны ингибирования (задержки) роста исследуемого микроорганизма.

• Метод менее чувствителен и менее точен, чем метод серийных разведений, но на практике применяется чаще из-за своей простоты. Размещено на реф.рф. • Скорость диффузии в агар любого препарата зависит от его структуры, молекулярной массы, наличия примесей, состава и рН среды. Метод бумажных дисков с антибиотиком (дискодиффузионный метод).

• Для проведения этого метода используют стандартные диски, содержащие определенное количество антибиотиков, и стандартную питательную среду, необходимую для роста данного вида микроорганизма. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК.

• На поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности. • Помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. • Инкубируют при уcловиях, благоприятных для каждого конкретного микроорганизма. • Измеряют диаметры зон задержки роста вокруг диска в миллиметрах (с учетом диаметра диска).

• Оценивают результат по специальной таблице путем сопоставления диаметра зон задержки роста испытанной культуры с пограничными значениями диаметра зоны в таблице. • Исследуемую культуру относят к одной из трех категорий: чувствительная, умеренно- чувствительная и устойчивая

Е-тест (E-test или эпсилометрический метод) Метод близок по технологии постановки к методу бумажных дисков. • В качестве носителя используется узкая полоска полимера (0.5х6.0 см), на которую нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных). Значения концентрации АБП в каждом участке полоски нанесены на наружной (обращенной к исследователю) поверхности. • Ингибирование роста микроорганизма вокруг полоски носителя происходит в зоне, где концентрация антибиотика, диффундирующего из носителя, выше МПК. • В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е- теста получают значение МПК. Е-тест сочетает простоту постановки метода бумажных дисков и точность метода серийных разведений

Методы, используемые для сравнительной оценки in vitro лекарственных средств антимикробной терапии: метод серийных разведений в жидкой и плотной питательных средах

  Методы серийных разведений: • Позволяют количественно оценить чувствительность выделенного микроорганизма к антибактериальным средствам и определить МПК препарата. • Используют для сравнительной оценки антимикробной активности in vitro разрабатываемого препарата-генерика и оригинального средства.

• Для определения величины МПК заданные концентрации антибиотиков вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма. После инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста. • Основаны на использовании двукратных последовательных разведений концентраций АБП от максимальной к минимальной (например, от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, и т.д.

до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл). • Проводятся в жидкой и агаризованной питательных средах. Метод серийных разведений в жидкой питательной среде (бульоне) Существует 2 варианта данного метода: макрометод (пробирочный) и микрометод (планшетный). Макрометод . • Тестирование проводят в пробирках в конечном объеме 1 мл для каждого разведения.

• Питательный бульон разливают по 0,5 мл в каждую пробирку. Количество пробирок определяют необходимым диапазоном разведений АБП.

• Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов: – Из стандартной суспензии каждого исследуемого микроорганизма (~ 10 8 КОЕ/мл) готовят рабочую суспензию ( ~ 10 6 КОЕ/мл) • Приготовление двукратных серийных разведений АБП: – готовят основной раствор АБП исследуемого препарата-генерика и препарата сравнения (оригинального) в концентрации 1000 мкг/мл и выше (с учетом содержания содержания активного вещества). -из основных растворов АБП исследуемого препарата-генерика и препарата сравнения (оригинального) готовят рабочие растворы АБП с использованием жидкой питательной среды. (Концентрация рабочих растворов рассчитывается исходя из необходимой максимальной концентрации в ряду серийных разведений с учетом фактора разбавления при последующей инокуляции суспензией микроорганизма) ‐ готовят серийные разведения: 0,5 мл рабочего раствора АБП вносят в первую пробирку, содержащую 0,5 мл бульона. Перемешивают. Новой пипеткой (наконечником) переносят 0,5 мл раствора АБП в бульоне во вторую пробирку, содержащую 0,5 мл бульона и т.д., пока не будет приготовлен весь необходимый ряд разведений. Из последней пробирки 0,5 мл удаляют. Т.о., получают ряд пробирок с растворами АБП, концентрации в которых отличаются в соседних пробирках в 2 раза • Инокуляция: по 0,5 мл микробной суспензии с концентрацией микроорганизма ~ 10 6 вносят в каждую пробирку с 0,5 мл соответствующего разведения АБП. Конечная концентрация микроорганизма в каждой пробирке ~ 5х10 5 КОЕ/мл. • Контроль – пробирка с бульоном и культурой микроорганизма (контроль роста). Отрицательный контроль – пробирка с бульоном (контроль стерильности). • Инкубирование: все пробирки, закрытые пробками, или колпачками, инкубируют при условиях, обеспечивающих рост испытуемых микроорганизмов. • Учет и интерпретация результатов: пробирки с посевами просматривают в проходящем свете. Рост культуры в пробирке с АБП сравнивают с контрольной пробиркой. – наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. ‐ по мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК). лекарственных средств антибактериальной терапии – сравнивают результаты, полученные для оригинального ЛС и исследуемого генерического ЛС. Делают вывод об их эквивалентности в отношении спектра (перечень используемых микрорганизмов) и степени антимикробной активности (значения МПК).

• Определение МБК: из нескольких последних пробирок с задержкой роста делают посев петлей на сектора чашки Петри. За МБК, которая, как правило, на несколько разведений меньше МПК, принимают концентрацию препарата в последней пробирке, посев из которой не дал роста. • Недостаток метода: низкая производительность – применение ограничивается исследованиями небольшого числа микроорганизмов.

Микрометод •Процедура проведения испытания аналогична таковой при использовании макрометода •Величина конечного объема – до 0,2 мл •Наличие соответствующего оснащения лаборатории: планшет на 96 лунок со стерильными крышками, многоканальных пипеток •Рабочие растворы АБП можно вносить в лунки планшет заранее, после чего хранить запаянными в полиэтилене при температуре ниже 60°С до момента использования. • Преимущества метода: – высокая производительность – возможность длительного хранения заранее приготовленных планшет – экономия расходных материалов. Размещено на реф.рф Метод серийных разведений в агаризованной среде • Принцип проведения испытания аналогичен методу разведений в бульоне • Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов: – стандартная суспензия каждого исследуемого микроорганизма должна содержать ~ 10 8 КОЕ/мл. – стандартную микробную суспензию для проведения эксперимента разводят ~ в 10 раз до получения концентрации микроорганизма ~ 10 7 КОЕ/мл • Приготовление двукратных серийных разведений АБП для оригинального препарата и исследуемого препарата- генерика проводят аналогично методу разведений в бульоне • Агаризованную среду расплавляют и охлаждают до температуры 45-50°С. • Приготовление чашек с агаризованной средой и разведениями АБП: смешивают агаризованную среду и растворы АБП непосредственно в чашке Петри (для пластиковых чашек диаметром 90 мм к 2 мл раствора АБП добавляют 18 мл расплавленного и охлажденного агара). • Инокуляция и инкубирование: бактериологической петлей переносят 1-2 мкл суспензии исследуемых микроорганизмов на поверхность агаризованной среды. Таким образом, конечная посевная доза составляет ~ 10 4 КОЕ (стандартная бактериологическая петля диаметром 3 мм переносит 1-2 мкл жидкости). • На поверхности агара образуется пятно диаметром 5-8 мм. После подсыхания чашки переворачивают и инкубируют при условиях, благоприятных для роста исследуемых микроорганизмов. • Учет и интерпретация результатов: аналогично методу разведения в бульоне. Чашки Петри помещают на темную, не отражающую свет поверхность. За МПК принимают концентрацию АБП, вызвавшую полное ингибирование видимого роста. • Контроль: инокулированные суспензией культур микроорганизмов чашки с агаром без АБП (контроль роста). Отрицательный контроль: чашки с агаром (контроль стерильности). Преимущества метода: на одной чашке можно определять чувствительность нескольких микроорганизмов.

Объем исследований по сравнительной оценке in vitro антимикробной активности для генерических и оригинальных средств антимикробной терапии

  Объем исследований по сравнительной оценке in vitro антимикробной активности генерических противомикробных лекарственных средств: •Задача исследования: подтверждение соответствия генерического препарата референсному (оригинальному) по спектру (микроорганизмы) и степени (значение МПК, МБК) антимикробной активности.

•Набор тестируемых микроорганизмов: по 1-2 штамма каждого из входящих в спектр действия микроорганизмов – эталонные коллекционные штаммы -выделенные в стационарах клинические штаммы •Определяются значения МПК и МБК •Контроль: препарат сравнения – оригинальный препарат •Ожидаемый результат: МПК и МБК разрабатываемых генерических противомикробных ЛС входят в допустимые диапазоны значений и полностью совпадают с МПК и МБК препаратов сравнения (оригинальных ЛС) в отношении коллекционных и клинических штаммов. Порядок исследований по определению in vitro антимикробной активности новых противомикробных соединений: •Первичная оценка чувствительности к новым соединениям эталонных штаммов различных видов грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов (4-5 штаммов для каждого вида); •Детальное изучение степени антибактериальной активности соединений в отношении штаммов грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов из международных коллекций с известными механизмами резистентности (метод серийных разведений); •Исследование активности в отношении клинических штаммов условно патогенных и патогенных микроорганизмов в сравнении с известными препаратами близкой химической группы или аналогичными по антимикробному эффекту: – в случае преимущественной активности в отношении грамположительных микроорганизмов контроль – природные пенициллины, цефалоспорины I – II поколений, макролиды, линкозамиды; – при активности в отношении грамотрицательных микроорганизмов контроль – полимиксин В, азтреонам; -для препаратов широкого спектра действия контроль – полусинтетические пенициллины, аминогликозиды, тетрациклины, цефалоспорины III – IV поколений • Оценка антимикробной активности в отношении проблемных возбудителей: метициллинорезистентные стафилококки, устойчивые к бензилпенициллину Streptococcus pneumonia, множественноустойчивые энтеробактерии, устойчивые к аминогликозидам бактерии рода Pseudomonas и др. •Первоначальные терапевтические концентрации новых препаратов устанавливаются с учетом токсичности, определенной в опытах по изучению острой токсичности;

• Сравнительную степень антибактериальной активности препаратов оценивают величиной МПК или МБК, определяемых не менее, чем при 2-х значениях посевной дозы: минимальной – 10 4 – 10 5 КОЕ/мл и максимальной – 10 6 – 10 9 КОЕ/мл в зависимости от вида возбудителя; На сегодняшний день не существует методов, которые позволили бы с абсолютной достоверностью прогнозировать клинический эффект антибиотиков при лечении инфекционных болезней. Однако, данные результатов определения чувствительности могут служить хорошим ориентиром клиницистам для выбора и коррекции антибактериальной терапии.

Источник: http://referatwork.ru/farmacevticheskaya_biologiya/section-32.html

Поделиться:
Нет комментариев

    Добавить комментарий

    Ваш e-mail не будет опубликован. Все поля обязательны для заполнения.